單抗製備常見問題分析

1.  為(wei) 什麽(me) 我的細胞生長很慢？
答：可能的原因：
（1）使用了劣質的培養(yang) 耗材、培養(yang) 基、血清、HAT或HT。建議新手使用廠商的試劑或耗材。對於(yu) 血清，可能需要從(cong) 多個(ge) 廠家選用多個(ge) 批次試用，選擇出比較好的批次進行實驗。在試用血清的時候，一般可以使用相對較低濃度的血清進行骨髓瘤細胞培養(yang) 實驗，根據骨髓瘤細胞的倍增速度確實血清質量。
（2）使用的血清或培養(yang) 基濃度不正確。仔細檢查配方是否正確。
（3）製備飼養(yang) 層的方法不正確。參見本頁麵第二個(ge) 問題。
（4）其它問題，可以參考本頁麵第二個(ge) 問題。
2.  為(wei) 什麽(me) 融合後細胞不長或者融合後克隆很少？
答：可以從(cong) 這幾個(ge) 方麵考慮：
（1）免疫用的動物品係不正確或者品係不純。免疫用的動物一般應該與(yu) 骨髓瘤來源的動物是相同品係，例如使用SP2/0骨髓瘤細胞時應該選用Balb/C小鼠，同時必須使用品係純正的小鼠。
（2）培養(yang) 基中加入了過高濃度的HAT，或者僅(jin) A的濃度過高或HT的濃度過低，建議用純的骨髓瘤和已有的雜交瘤作HAT濃度篩選。
（3）培養(yang) 基不正確或血清濃度不正確或使用了劣質血清。
（4）未正確製備飼養(yang) 層細胞。參見本站有關(guan) 飼養(yang) 層細胞製備的部份。
（5）接種雜交瘤細胞的培養(yang) 板過多。一般在5-20塊96孔板為(wei) 宜。
（6）融合後，未及時轉移或稀釋細胞。有人在做融合後喜歡把融合的細胞先放在培養(yang) 瓶中培養(yang) ，然後再滴到96孔板上。如果在培養(yang) 瓶中培養(yang) 的時間過長，也可能出現克隆利率少的情況。
（7）細胞被汙染。在顯微鏡下仔細觀察是否有明顯的微生物汙染。即使看不到有明顯的微生物，也應該考慮是否有支原體(ti) 汙染，有條件的可以做支原體(ti) 檢測。
（8）細胞培養(yang) 條件不正確，確保細胞培養(yang) 在恒定的37度較濕的環境，同時保證CO2濃度在4-5%左右。
（9）其它與(yu) 融合條件相關(guan) 的不恰當的因素。詳見本站有關(guan) 細胞融合的部份。
3.  為(wei) 什麽(me) 我凍存的細胞很難複蘇或者複蘇不活？
答：這個(ge) 問題要從(cong) 兩(liang) 個(ge) 方麵來回答，一是凍存方麵，二是複蘇問題。 對於(yu) 凍存過程，需要注意：
（1）凍存液的配方。這個(ge) 問題很關(guan) 鍵，一個(ge) 良好的凍存液配方可以使細胞保存得非常好，而一個(ge) 不好的凍存液配方可能會(hui) 讓細胞傾(qing) 刻死亡。目前認為(wei) 比較好的配方有：10%DMSO+90%胎牛血清和10%DMSO+90%養(yang) 過雜交瘤的培養(yang) 基，不管是哪一種，凍存保護劑DMSO的含量非常重要，如果這個(ge) 濃度過低，則起不到保護作用，凍存的細胞終會(hui) 死於(yu) 冰晶形成時的張力，如果濃度過高，則細胞中毒而亡。如果使用第二個(ge) 配方，注意一定要用養(yang) 過雜交瘤的培養(yang) 基，而盡量不要用一般的*培養(yang) 基，而且一定是配養(yang) 需要凍存的那一株的培養(yang) 基。文獻中也有提到用甘油作為(wei) 凍存保護劑的，站長自己沒有親(qin) 自試過，不發表評論。如果新手確實對這個(ge) 沒把握，上也有商品化的凍存液，買(mai) 回來按照說明書(shu) 操作就OK了。
（2）凍存過程中，不可用力過大，在凍存液中重懸細胞的時候更是要輕柔，因為(wei) 在DMSO存在的條件下，細胞膜變得非常脆弱，如果用力過猛，則細胞膜很容易破，複蘇成活的機會(hui) 就明顯會(hui) 下降。
（3）凍存的程序也非常重要。實踐表明，以每分鍾1 ℃的速度下降凍存細胞是的。如果條件簡易，可以把細胞放在4 ℃半小時左右，然後再在-20 ℃放置1-2小時，後轉入-80 ℃放置一晚上，終轉入液氮保存。需要短期保存的，直接放-80 ℃也行。現在上有比較貴的凍存盒，把需要存放的細胞放進去，然後直接放-80 ℃就行，等時間夠長後直接轉至液氮中即可。
（4）細胞需要保存在液氮的氣相中，而不是泡在液相裏。否則液氮很容易進入凍存管。這一點很多人都沒有注意，大部份人都是直接往液相裏放，其實這是錯誤的。有人認為(wei) ，普通的液氮中可能含有微生物或者孢子什麽(me) 的，如果放在液相中，這些微生物或孢子就有機會(hui) 進入凍存管，終可能造成細胞汙染。
（5）保證被凍存的細胞處於(yu) 良好的生長狀態，並且沒有被汙染。
4.  為(wei) 什麽(me) 免疫後沒有效價(jia) 或免疫後效價(jia) 低？