菌株的保藏方法

菌株的保藏方法

1.載體(ti) 保存法：即將微生物吸附在適當載體(ti) 上進行幹燥保存的方法。常用的有方法包括以下幾種，如

① 土壤保存法：主要用於(yu) 能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏。方法是在滅菌的土壤中加入菌液，立即在室溫下進行幹燥或使菌體(ti) 繁殖後再幹燥，然後冷藏或在室溫下密封保存。保存用的土壤原則上以肥沃的耕土為(wei) 宜，土壤需風幹、粉碎、過篩和滅菌。

使微生物在土壤中繁殖後進行幹燥保存的方法是：取適量土壤（5克）置於(yu) 塞有棉塞的試管中，加水或加入充分稀釋的液體(ti) 培養(yang) 基（以含水量為(wei) 土壤大持水量的60%為(wei) 宜），然後高壓滅菌。再將需保存的微生物進行大量接種，培養(yang) 至菌絲(si) 能用肉眼確認的程度為(wei) 止，移入幹燥器中經短時間幹燥或風幹後密封，冷藏或室溫保存。

② 砂土保存法：取清潔的砂，過60目篩去掉大砂粒，並用磁鐵吸去砂中鐵屑，再用NaOH溶液、10% HCl溶液和水交替清洗數次，幹燥後，置於(yu) 試管或安瓶管中保持2～3cm深，再經幹熱滅菌後，加入1ml菌種培養(yang) 液，經充分混勻後，放入真空幹燥器中，*幹燥後熔封保存。也可用二份洗淨的砂（經HCl預處理）和一份貧瘠、過篩的黃土攙和後滅菌，再進行菌種保藏。

③ 矽膠保存法：以6～16目的無色矽膠代替砂子，幹熱滅菌後，加入菌液。加菌液時，由於(yu) 矽膠的吸附熱常使溫度升高，因而需設法加以冷卻。

④ 磁珠保存法：將菌液浸入素燒磁珠（或多孔玻璃珠）後再進行幹燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的矽膠（或無水CaSO4），上鋪玻璃棉，再放上10～20粒磁珠，經幹熱滅菌後，接入菌懸液，後冷藏、室溫保藏或減壓幹燥後密封保藏。本法對酵母菌很有效，特別適用於(yu) 根瘤菌，可保存長達兩(liang) 年半時間。

⑤ 麩皮保存法：在麩皮內(nei) 加入60%的水，經滅菌後接種培養(yang) ，後幹燥保藏。

⑥ 紙片（濾紙）保存法：將滅菌紙片浸入培養(yang) 液或菌懸液中，常壓或減壓幹燥後，置於(yu) 裝有幹燥劑的容器內(nei) 進行保存。

2.

冷凍保存法：適用於(yu) 抗凍力強的微生物。這些微生物可在其菌體(ti) 細胞外遭受凍結的情況下而不受損傷(shang) ，而對其它大多數微生物而言，無論在細胞外凍結還是在細胞內(nei) 凍結，都會(hui) 對菌體(ti) 造成損傷(shang) ，因此當采用這種保藏方法時，應注意以下幾點，

① 要選擇適於(yu) 冷凍幹燥的菌齡細胞；

② 要選擇適宜的培養(yang) 基，因為(wei) 某些微生物對冷凍的抵抗力，常隨培養(yang) 基成分的變化而顯示出巨大差異；

③ 要選擇合適的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越高，保存期也越長；

④ 在菌液內(nei) 不添加電解質（如食鹽等）；

⑤ 可在菌液內(nei) 添加甘油等保護劑，以防止在冷凍過程中出現菌體(ti) 大量死亡的現象。同樣，也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護效果的溶劑，但對有些微生物而言，不加保護劑時更有效。

⑥ 原則上應盡快進行冷凍處理，但當加入保護劑時，可靜置一段時間後再進行處理。

⑦ 就動物細胞而言，應在－20℃範圍內(nei) 以1℃/min左右的速度緩慢降溫，此後必須盡快降到貯藏溫度；而對絕大多數微生物而言，則不必如此，如結構較為(wei) 複雜的原蟲則可在－35℃範圍內(nei) 進行緩慢降溫，而噬菌體(ti) 則必需采用上述的二階段法進行冷凍；

⑧ 若進行長期保存，則貯藏溫度越低越好；

⑨ 取用冷凍保存的菌種時，應采取速融措施，即在35～40℃溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來說，則應選擇靜置融化的措施。當冷凍菌融化後，應盡量避免再次冷凍，否則菌體(ti) 的存活率將顯著下降。

3.傳(chuan) 代保存法：有些微生物當遇到冷凍或幹燥等處理時，會(hui) 很快死亡，因此在這種情況下，隻能求助於(yu) 傳(chuan) 代培養(yang) 保存法。傳(chuan) 代培養(yang) 就是要定期地進行菌種轉接、培養(yang) 後再保存，它是基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生產(chan) 菌種的保存。

傳(chuan) 代保存時，培養(yang) 基的濃度不宜過高，營養(yang) 成分不宜過於(yu) 豐(feng) 富，尤其是碳水化合物的濃度應在可能的範圍內(nei) 盡量降低。培養(yang) 溫度通常以稍低於(yu) 適生長溫度為(wei) 好。若為(wei) 產(chan) 酸菌種，則應在培養(yang) 基中添加少量碳酸鈣。

一般地，大多數菌種的保藏溫度以5℃為(wei) 好，像厭氧菌、霍亂(luan) 弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37℃進行保存，而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。

傳(chuan) 代培養(yang) 保存法雖然簡便，但其缺點也很明顯，如：①菌種管棉塞經常容易發黴；②菌株的遺傳(chuan) 性狀容易發生變異；③反複傳(chuan) 代時，菌株的病原性、形成生理活性物質的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期轉種，工作量大；⑤雜菌的汙染機會(hui) 較多。          

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